J. Bras. Nefrol. 2009;31(2):120-4.
A nefrocalcina é uma proteína ligada à membrana? Uma hipótese bioquímica
Resumo:
Introdução: A nefrocalcina (NC) é uma glicoproteína urinária que desempenha papel importante na inibição da cristalização do oxalato de cálcio (OxCa). A NC ocorre em pelo menos quatro isoformas (NC-A, B, C e D). As isoformas da NC são fosfoproteínas, mas a quantidade anormalmente elevada de resíduos de fosfato, em especial nas NC-C e D é intrigante. A NC poderia revestir a superfície de células epiteliais renais para evitar adesão de cristais de OxCa e conjugar fosfolípides da membrana em sua molécula. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os fosfolipídios presentes na molécula de NC. Material e Métodos: A NC e suas isoformas foram isoladas da urina de indivíduo não portador de nefrolitíase. O conteúdo de fosfato foi determinado em cada isoforma. A taxa de inibição de crescimento de cristais de OxCa causada pela NC foi medida pelo consumo do ácido oxálico. A separação de lipídios, fosfolípides e proteínas foi realizada utilizando-se o método de separação Triton X-114. Resultados: Foram identificados os seguintes compostos: fosfatidilcolina, fosfoeta-nolamina, fosfatidilinositol, triglicérides e lipídios neutros. A composição de aminoácidos das isoformas da NC não se alterou. Após a extração com Triton X-114, os resíduos de fosfato das isoformas B, C e D diminuíram quase 1/10 do valor original e os da isoforma A não se alteraram. A constante de dissociação em direção ao oxalato de cálcio não foi alterada. Conclusão: Estes dados indicam a presença de fosfolípides típicos de membrana celular presentes na molécula de NC. A NC, incluindo-se todas as suas isoformas, pode ser uma proteína ligada à membrana, ao conjugar fosfolípides e revestir a superfície de células epiteliais tubulares.
Descritores: cálculo renal, oxalato de cálcio, inibidor, nefrocalcina, nefrolitíase.
Abstract:
Introduction: Nephrocalcin (NC) is a urinary glycoprotein that plays an important role in the inhibition of calcium oxalate crystallization. NC occurs in at least four isoforms (NC-A, -B, -C, and -D). NC isoforms are phosphoproteins, but the abnormally high phosphate residues, particularly in NC-C and NC-D, are intriguing. It is possible that NC molecules could coat the surface of renal epithelial cells for preventing attachment of calcium oxalate crystals, and could conjugate membrane phospholipids (PL). Our objective was to identify and characterize PL in NC. Material and Methods: NC and its four isoforms were isolated from non-stone forming urine. Phosphate contents were determined. Crystal growth inhibition rate of NC toward calcium oxalate monohydrate crystals (COM) was measured by decrease of oxalic acid. Phase separation of lipids and PL from proteins was carried out by a phase separation method using Triton X-114. Results: The following compounds were identified: phosphatidylcholine, phosphoethanolamine, phosphatidylinositol, triglycerides, and neutral lipids. Amino acid composition of the four NC isoforms before and after extraction did not change. After Triton X-114 extraction, phosphate residues in isoforms B, C, and D were decreased nearly 1/10 of the original value. However, isoform A phosphate residues showed no change. Dissociation constant toward calcium oxalate was not significantly altered. Conclusions: These data indicate the presence of typical membrane PL in NC molecule. NC, including all its isoforms, could be a membrane bound protein, conjugating membrane PL and coating the surface of the epithelial renal cells.
Descriptors: kidney stone, calcium oxalate, kidney stone inhibitor, nephrocalcin, nephrolithiasis.
INTRODUÇÃO
A nefrocalcina (NC) é uma glicoproteína que desempenha um papel importante na inibição da cristalização urinária.1,2 A NC afeta a forma de crescimento, tamanho e estrutura do cristal dos cristais de oxalato de cálcio.3 Na verdade, a NC controla a conversão dos cristais monoidratados de oxalato de cálcio (não octaédricos) em cristais octaédricos cúbicos pequenos, que são mais característicos do oxalato de cálcio diidratado.4
A NC é encontrada em muitas formas poliméricas, com pesos moleculares variando de 14 a 68 kDa, e é eluída em DEAE-celulose em pelo menos quatro isoformas de NC (NC-A, B, C e D). Há uma forte correlação entre a probabilidade de um paciente desenvolver cálculos renais e as proporções das diferentes isoformas na urina.5 Indivíduos com maior probabilidade de formar cálculos renais excretam maiores proporções das isoformas NC-C e D do que NC-A e B.6 Semelhante à urina dos formadores de cálculo, extratos de cálculos renais removidos cirurgicamente compostos em mais de 60% por oxalato de cálcio também exibiam mais NC-C e D do que A e B.4
As NC-A e B exibem propriedades bioquímicas e funcionais diferentes comparadas às NC-C e D. Em pacientes com nefrolitíase, as constantes de dissociação da NC-A e B para os cristais de oxalato de cálcio são de aproximadamente 1 × 10-7 M, enquanto as da NC-C e D são de apenas 1 a 10 × 10-6 M, indicando que a NC-A e B se ligam a esses cristais com uma firmeza dez vezes maior, no mínimo, que aquela apresentada pela NC-C e D.4,6 Os espectros de dicroísmo circular mostram que NC-A e B alteram a conformação mediante ligação com o cálcio, ainda que as isoformas C e D não o façam.7
As isoformas da NC contêm grande quantidade de fosfato. De forma interessante, quando investigamos a fosforilação e glicosilação de NC-C usando P31-NMR, nós observamos que parte da fosforilação ocorria no grupo – OH serina.8 A desfosforilação pela fosfatase alcalina e a deglicosilação química diminuíam o conteúdo de fosfato, mas uma quantidade significativa de fosfato permanecia na molécula.
Consideramos que as isoformas da NC são fosfoproteínas, mas os resíduos de fosfato anormalmente elevados, particularmente na NC-C e D, é intrigante. Então levantamos a hipótese que as moléculas da NC poderiam revestir a superfície interna do túbulo proximal impedindo a fixação dos cristais de oxalato de cálcio9,10 e nessa situação poderia conjugar aos fosfolípides da membrana.
Nosso objetivo neste estudo foi identificar e caracterizar os possíveis fosfolípides na NC usando métodos de separação em fases.
MATERIAL E MÉTODOS
A nefrocalcina e suas quatro isoformas foram purificadas em uma amostra de urina de 24 horas obtida de um homem sadio sem história pessoal de cálculo renal, doenças conhecidas ou uso de qualquer medicamento crônico como descrito anteriormente.6,11 A análise dos aminoácidos foi realizada depois de ser hidrolisada em tubo lacrado contendo 6 N HCl a 110ºC por 24 h e submetida ao Beckman amino acid analyzer modelo 118C.
Os conteúdos de fosfato foram determinados pelo método relatado por Ames e Dublin12 Em resumo, uma amostra de NC foi digerida com 60 µL de Mg(NO3)2 a 10% em etanol 5 em chama aberta (open flame), seguido por hidrólise com 1 NHCl em água em ebulição durante 15 minutos, com subsequente desenvolvimento de cor através da adição de reagente molibdato/ascórbico de amônio. A curva de calibração foi preparada utilizando como solução padrão estoque 0,01 M de KH2(PO4) através da medida da absorbância em 820 nm. O espectrofotômetro usado foi o Beckman DU 640.
A taxa de inibição de crescimento do cristal pela NC para cristais de oxalato de cálcio monoidratados (COM) foi medida pela diminuição de ácido oxálico em 214 nm na presença de um pequeno cristal em pH 5,8 usando um espectrofotômetro conectado a um computador para determinação da taxa de reação de segunda ordem, como previamente relatado.5 A constante de dissociação foi calculada a partir a inclinação no modelo linear isoterma de Langmuir.5
A fase de separação dos lipídios e fosfolípides e das proteínas foi realizada pelo método de separação usando Triton X-114, conforme relatado por Bordier.13 NC, 500 µl, em 0,02 M de Tris-HCl, em pH 7,2 contendo 0,2 M de NaCl, foi incubada com 100 µL de Triton X-114 pré-condensado a 4ºC durante 20 minutos e então transferida para uma incubadora a 37ºC durante 30 minutos. A mistura turva foi centrifugada a 7.000 x g durante 10 minutos, separando a camada inferior (fração Triton X-114) e a camada superior (fração aquosa da proteína).
Cromatografia em camada delgada foi realizada em placa de sílica gel G (20 ×20 cm). A placa de sílica gel G (Analtech Inc. Newark, DE, EUA) usada apresentava poro com tamanho médio de 70 Aº revestindo 0,25 mm da espessura na placa de vidro. A placa foi ativada por aquecimento a 100ºC durante 30 minutos em forno ante do uso. As amostras foram desenvolvidas em duas dimensões: clorofórmio/metanol/28% amônia (65/35/5, v/v/v) para a primeira dimensão e clorofórmio/metanol/acetona/ácido acético/água (20/10/40/10/5, v/v/v/v/v) para a segunda dimensão. Todos os solventes usados eram de classe HPLC e foram obtidos na Fischer Scientific Co. O cromatograma desenvolvido foi avaliado por dois métodos. Primeiro, a placa foi exposta a vapor iodado e os pontos foram registrados. Após a remoção do vapor iodado, foi borrifada uma solução aquosa de 0,0012% Rhodamine 6G e os pontos fluorescentes foram observados em uma lâmpada de 365 nm UV.
A derivatização dos ácidos graxos foi realizada com o uso do reagente 9-antrildiazometano (ADAM). O ADAM foi sintetizado a partir do 9-antraldeído e hidrato de hidrazina em etanol seguindo o método descrito por Nakaya.14 Uma alíquota de 200 µL da solução padrão de ácidos graxos, ou da fração Triton X-114 em metanol, foi misturada a 400 µL de ADAM (6,3 mg/mL de acetona) e mantida no escuro em temperatura ambiente durante a noite. Os lípides padrão que se seguem foram adquiridos da Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, EUA): fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, colesterol, ácido decanoico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico e acido linoleico. Os lípides derivatizados foram analisados pelo sistema Beckman HPLC (166 detector e 125 solvent module) usando a coluna de fase reversa C18 (Water Bondapk C18, 2 × 300 mm). A sequência foi a seguinte: sistema solvente, modo isocrático em metanol/água (47/53, v/v), escoamento em 0,5 mL/min e detecção em comprimento de onda de 210 nm.
RESULTADOS
Após a fase de separação, a maior parte do componente proteico da NC foi encontrada na camada aquosa, e os lípides e fosfolípides continuaram na fase Triton X-114.
A composição dos lípides e fosfolípides nas frações Triton X-114 foi examinada pelo TLC, sendo desenvolvido um cromatograma. Nesse método, os fosfatídeos ácidos e outros lípides mostram fluorescência azul ou púrpura, e os lípides neutros e fosfatídeos neutros apresentam coloração amarela ou alaranjada sob luz UV (366 nm). De acordo com essas colorações e valores Rf comparados aos padrões, foram identificados os seguintes compostos: fosfatidilcolina, fosfoetanolamina, fosfatidilinositol, triglicérides e lípides neutros. Em seguida, esses extratos Triton X-114 foram modificados pelo ADAM e submetidos às analises em HPLCs. Os seguintes ácidos graxos foram identificados no tempo de retenção: C10 (ácido decanoico), C12 (ácido láurico), C16-1 (ácido palmitoleico), C-18 (ácido esteárico), C18-1 (ácido oleico), C18-2 (ácido linoleico) e C18-3 (ácido linolênico).
A composição de aminoácidos nas quatro isoformas de NC antes e depois da extração Triton X-114 (camada aquosa) não se alterou. Todos os resíduos dos aminoácidos foram os mesmos dentro de uma margem de erro experimental estreita antes e depois da extração com detergente.
O conteúdo de fosfato foi comparado antes e depois da extração Triton X-114, e os resultados são apresentados na Tabela 1. As isoformas NC-C e D continham mais resíduos fosfato comparadas às isoformas A e B. Após a extração do Triton X-114, os resíduos fosfato nas isoformas B, C e D diminuíram em quase 1/10 em relação ao valor original. No entanto, os resíduos fosfato na isoforma A não mostraram alteração.
A constante de dissociação para COM é apresentada na Tabela 1. As isoformas A e B não mostraram diferenças antes e depois da remoção do fosfato. Os valores das isoformas C e D diminuíram em uma ordem, indicando leve diminuição na afinidade ao COM comparado às isoformas A e B.
DISCUSSÃO
Neste estudo, pudemos mostrar que a NC tem uma quantidade significante de fosfato, composta em parte por diversos fosfolípides. Uma possível explicação para esse achado poderia ser a fixação da NC nas células do epitélio tubular renal e posterior incorporação desses fosfolípides de membrana em sua molécula.
Algumas macromoléculas presentes na urina podem promover ou inibir a cristalização urinária dependendo das condições predominantes na urina. A proteína de Tamm-Horsfall (THP), por exemplo, tem sido implicada na formação do cálculo, inibindo a agregação do cristal de oxalato de cálcio.15 No entanto, condições de alta força iônica na urina e baixo pH urinário favorecem a autoagregação e formação do cristal.16 A proteína de TH em solução pode se comportar de forma diferente quando é fixada ou adsorvida em uma superfície. Rindler et al., usando o mesmo ensaio de separação que o usado por nós, foi capaz de demonstrar que a THP tem um caráter hidrofóbico quando afixado às membranas celulares, diferente da sua característica hidrofílica após isolamento em urina humana.17 Além disso, eles mostraram que a THP faz parte das proteínas de membrana da classe das glicosilfosfatidilinositol (GPI) ligadas a lípides e é liberada na urina após perder seu ancorador hidrofóbico, provavelmente por ação de uma fosfolipase ou protease.17
Neste estudo, a fase de separação com Triton X-114 foi usada sem a desnaturação da proteína, e nós observamos a presença dos fosfolípides, lípides e ácidos graxos na molécula de NC. A partir do TLC de duas dimensões e modificação química dos ácidos graxos seguido pela separação por HPLC, identificamos os lípides e fosfolípides que são constituintes típicos das membranas celulares. Julgando-se pelas composições lipídicas apresentadas neste estudo (ácido linoleico, linolênico, oleico e palmitoleico, fosfoetanolamina, fosfatidilinositol, ácido esteárico) e pelas composições de carboidratos previamente relatadas por nós (galactose, glicose, glicosamina, galactosamina, manose e ácido N-acetilneuramínico),11 as isoformas da NC poderiam ser uma proteína ligada à superfície da célula por GPI.
As glicoproteínas urinárias são inibidores importantes da cristalização do oxalato de cálcio e adesão dos cristais às células renais, sendo ambos os mecanismos fundamentais na nefrolitíase.18 Diversas proteínas renais ligadas e solúveis modulam ou mesmo regulam esses eventos.19 Lieske et al., usando células epiteliais renais (linhagem de células BSC-1), demonstraram que a nefrocalcina, uropontina e citrato inibem a ligação dos cristais de oxalato de cálcio.9 Nós postulamos que a NC presente no fluido tubular e na superfície das células do epitélio tubular renal poderia ajudar a determinar se uma interação cristal-célula resultaria na retenção do cristal ou na sua passagem para fora do néfron. Nossos resultados também sugerem que os fosfolípides e lípides encontrados nos cálculos renais formados por oxalato de cálcio seriam de matriz proteica e esses lípides não teriam uma função direta na formação dos cálculos renais.
A isoforma NC-A não continha lípides, mas as isoformas B, C e D continham lípides e fosfolípides, conforme apresentado na Tabela 1. Quando esses lípides eram separados das moléculas de NC, a constante de dissociação para o oxalato de cálcio das isoformas C e D mostraram apenas uma pequena variação (de 10-7 para 10-6 M) e a composição de aminoácidos não se alterou. Esta observação indica que os lípides e os fosfolípides não são absolutamente necessários para a ligação da NC ao oxalato de cálcio. Esses dados são concordantes com nossos estudos prévios que indicaram que todos os quatro isômeros ligam 4 átomos de Ca direta ou indiretamente aos grupos carbosil dos aminoácidos.7
CONCLUSÕES
A defesa natural contra a nefrolitíase pode incluir a não fixação do cristal pelo efeito de inibidores macromoleculares como a nefrocalcina. Nossos dados nesse estudo sugerem que a grande quantidade e tipos de fosfolípides encontrados na molécula da NC poderiam ser adquiridos a partir da interação da NC com as células do epitélio tubular renal. A NC, incluindo todas as suas isoformas, pode ser uma proteína ligada à membrana revestindo a superfície das células epiteliais renais.
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1. Departamento de Clínica Médica, Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná
2. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Departamento de Medicina, Universidade de Chicago
Correspondência para:
Mauricio Carvalho
Hospital de Clínicas da UFPR Departamento de Clínica Médica
Rua General Carneiro, 181 – 10º andar
Curitiba – Paraná CEP: 80060-900
E-mail: carvalho@mais.sul.com.br
Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.
Data de submissão: 02/3/2009
Data de aprovação: 12/5/2009
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