J. Bras. Nefrol. 2002;24(1 suppl. 2):9-18.
Actividad inmunosupresora de preparaciones de ciclosporina A en células mononucleares
Immunosuppressive activity of cyclosporine A formulations in mononuclear cells
Resumo:
Objetivo: Comparar la actividad inmunosupresora in vitro de dos formulaciones comerciales de ciclosporina A (Sigmasporin Microral®, Sigmapharma, Brasil y Sandimmun Neoral®, Novartis, Suiza), en células mononucleares de voluntarios sanos como también de pacientes renales crónicos. Métodos: Se solicitaron ambas formulaciones, en sus embalajes comerciales, a la farmacia del hospital, siendo transferidas para frascos idénticos y rotulados por un investigador independiente como ciclosporina 1 y 2. Se establecieron curvas de concentraciones para las dos preparaciones, siendo evaluada su capacidad de inhibición de la proliferación de células mononucleares inducida por fitohemaglutinina (PHA) en cultivos de linfocitos de sangre periférica y en sangre entera, obtenidas de voluntarios sanos (n=12) al igual que de 11 pacientes de hemodiálisis. Resultados: El estudio demostró que las dos formulaciones comerciales son inmunosupresoras, con curvas semejantes, aunque estadísticamente diferentes, de inhibición de la proliferación de células mononucleares inducidas por PHA, en linfocitos de sangre periférica y en sangre entera de voluntarios sanos, y sin diferencia estadísticamente significativa en sangre entera de pacientes hemodialisados, en las concentraciones sometidas a testes. Conclusión: Las dos formulaciones comerciales de ciclosporina estudiadas presentaron actividad inmunosupresora equivalente.
Descritores: Ciclosporina A. Proliferación de células mononucleares. Hemodiálisis.
Abstract:
Objective: To compare the immunosuppressive activity of two commercial formulations of cyclosporine A (Sigmasporin Microral®, Sigma Pharma, Brazil, and Sandimmun Neoral®, Novartis, Switzerland), in mononuclear cells from healthy volunteers as well as from chronic renal patients. Methods: Both formulations, in their commercial packages, were requested from the hospital pharmacy, transferred to identical vials and labeled by an independent researcher as cyclosporine I and 2. Concentration curves were established for the two preparations and their inhibitory capacity on PHA-induced mononuclear cell proliferation was measured in cultured peripheral blood lymphocytes and whole blood obtained from I2 healthy volunteers as well as from II hemodialysis patients. Results: The study showed that both commercial formulations are immunosuppressive with similar but statistically different inhibition curves for PHA-induced mononuclear cell proliferation, in peripheral blood lymphocytes and in whole blood from healthy volunteers, and statistically not different in whole blood from hemodialysis patients at the concentrations tested. Conclusion: The two commercial cyclosporine formulations studied showed equivalent immunosuppressive activity.
Descriptors: Cyclosporine A, mononuclear cell proliferation, hemodialysis
INTRODUCCION
La utilizacion de medicamentos genericos puede reducir de manera notable los costos de cuidados con la sulad en el periodo postransplante.1, 2 Los esfuerzos para el desarrollo de estos medicamentos ha sido estimulado por las Agencias Reguladoras de Salud en ambito internacional. La metodologia y las exigencias para la aprobacion de medicamentos genericos son rigurosas, e involucran estudios controlados de bioequivalencia cuyo objetivo final es determinar si el medicamento generico es absorbido manteniendo niveles sanguineos similares comparado al estandar de referencia. Pero, no son requeridos testes de actividad biologica. En la practica, se parte del supuesto de que las nuevas formulaciones, una vez absorbidas y habiendo alcanzado concentraciones sericas adecuadas, presentaran la misma actividad biologica originalmente descrita como terapeutica. En el caso particular de la ciclosporina, su actividad biologica como agente inmunosupresor es vital para el exito de los transplantes. El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar la actividad biologica inmunosupresora de dos preparaciones de ciclosporina en microemulsion, existentes en el mercado brasileno (Sigmasporin Microral® y Sandimun Neoral®), con la finalidad de ofrecer una contribucion cientifica para el proceso de tomada de decisiones de la comunidad de transplantes.
MÉTODOS
Drogas y reactivos
Se solicitaron Sigmasporin Microral® (SigmaPharma Nature’s Plus, Brasil) y Sandimun Neoral® (Novartis, Suiza) a la farmacia del “Hospital Universitario Antonio Pedro”, Niteroi, Rio de Janeiro, Brasil en solucion oral con 100 mg/ml. Ambos preparados se diluyeron en medio de cultivo RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, EE.UU.), y fueron acondicionados en frascos esteriles, identicos, de color ambar, almacenados protegidos de la luz, e identificados aleatoriamente como Ciclosporina 1 y Ciclosporina 2 por un investigador independiente, quien proveyo el codigo de identificacion solamente despues de la obtencion de los resultados. En los cultivos celulares, tambien se utilizaron los siguientes reactivos: RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, EE.UU.), suero fetal bovino (Fazenda Pigue, Brasil), PHA (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
Preparaciones celulares
Fue colectada y procesada sangre venosa heparinizada de voluntarios sanos y de pacientes hemodialisados para obtener dos preparaciones celulares diferentes: para la preparacion de sangre entera, esta se diluyo en RPMI-1640 (1:5) y para la preparacion de celulas mononucleares de sangre periferica, la sangre se fracciono por centrifugacion en un gradiente de densidad por Ficoll-Hypaque (Sigma, St. Louis, EE.UU.); la fraccion mononuclear obtenida se lavo dos veces y se suspendio en RPMI con 5% de suero fetal bovino, siedo ajustado el numero de celulas para 1 X 106 celulas/ml.
Ensayo de proliferacion
Las mediciones de proliferacion de las celulas mononucleares fueron realizadas determinando la incorporacion de 3H-Timidina al ADN celular.3 Ambas preparaciones fueron transferidas para placas de cultivo de 96 pocillos, a las que se les agrego fitohemaglutinina (PHA), 5 µg/ml, en presencia o en ausencia de una curva de concentracion de ciclosporina 1 y 2 (20 ng/ml a 200 µg/ml), recien diluidas, e incubadas a 37ºC, en atmosfera esteril, con 5% de CO2, durante 72 horas (linfocitos perifericos) o 120 horas (sangre entera). Seis horas antes de finalizar el periodo de incubacion, los cultivos celulares fueron pulsados con 0,5 µCi de 3H-Timidina, y despues de haber transcurrido este tiempo, las celulas fueron recogidas, usando un contador de liquido de cintilacion para determinar la radioactividad.3 El procedimiento de procesamiento de las muestras esta indicado en la Figura 1.
Figura 1 – Ensayo de proliferación de células mononucleares inducidas por fitohemaglutinina (PHA), en sangre entera (a la izquierda) y en células mononucleares de sangre periférica (a la derecha).
Analisis estadístico
Los resultados son presentados como promedio (figuras) o promedio y desvio estandar (texto). Los resultados de los grupos que pertenecen a cada una de las tres situaciones experimentales (celulas aisladas de voluntarios, sangre entera de voluntarios y sangre entera de hemodialisados) fueron tratados estadisticamente de modo independiente y fueron evaluados por one-way Anova [de via unica], mediante el empleo del programa EPISTAT. Fue establecido un nivel de significancia de p<0,05.
RESULTADOS
Las caracteristicas de los grupos del estúdio (voluntarios sanos y hemodialisados) se encuentran resumidas en la Tabla 1.
Voluntarios sanos
La Figura 2 muestra los resultados obtenidos con ambos preparados de ciclosporina, comparando sus respectivas capacidades de inhibicion de la proliferation de celulas mononucleares inducida por PHA. Los valores observados reflejan el promedio de la inhibicion de la proliferation del conjunto de los voluntarios incluidos en el ensayo (n=12). En esta preparacion, obtenida a partir de celulas mononucleares perifericas, se constata que las curvas son semejantes en ambas formulaciones de ciclosporina. A pesar de ser estadisticamente significativa, la pequena diferencia se observo solamente en la concentration de 20 ng/ml, en la que la inhibicion de la proliferation por parte de la CsA1 (23,6±2,4%) fue superior a la de CsA2 (20,2±1,1%), p<0,01.
Figura 2 – Porcentaje de inhibición de la proliferación de células mononucleares inducida por PHA en la sangre periférica de controles saludables: CsA 1 (barras vacías) y CsA 2 (barras llenas). *p<0,05 vs. CsA1
El efecto inhibitorio obtenido en cultivos de sangre entera (Figura 3) de las 2 preparaciones fue estadisticamente diferente en las concentraciones de 200 ng/ml y 2 ug/ml, en este caso a favor de la CsA2 (50,5±2,2% vs. 56,5±3,6% y 70,3±1,9% vs. 74,4±2,9% para las concentraciones de 200 ng/ml y 2ug/ml, respectivamente, p<0,001 en ambas situaciones).
Figura 3 – Porcentaje de la proliferación de células mononucleares inducida por PHA en sangre entera total de controles sanos: CsA1 (barras vacías) y CsA2 (barras llenas). *p<0,05 vs. CsA1
Pacientes hemodialisados
Este grupo fue constituido por 13 pacientes adultos con insuficiencia renal cronica y bajo tratamiento de hemodialisis, cuya sangre fue recolectada en el momento previo al procedimiento de dialisis. Solamente 11 muestras fueron consideradas adecuadas para analisis, debido a que las muestras de dos pacientes no presentaron respuesta proliferativa. Los resultados encontrados, restringidos al ensayo de proliferacion con sangre entera, se encuentran en la Figura 4. En este grupo, los resultados obtenidos con ambos preparados de ciclosporina no presentan diferencias estadisticamente significativas.
Figura 4 – Porcentaje de inhibición de la proliferación de células mononucleares inducidas por PHA en sangre entera de hemodialisados: CsA1 (barras vacías) y CsA2 (barras llenas).
Apertura del protocolo ciego
La apertura del codigo de identificacion de los preparados de ciclosporina estudiado por un investigador independiente, revelo que el preparado identificado como CsA 1 correspondio a Sandimmun Neoral® y el identificado como CsA 2 corresponde a Sigmasporin Microral®.
DISCUSION
El objetivo de este estudio fue investigar la capacidad de inhibicion de las formulaciones sobre la proliferacion de celulas mononucleares inducidas por fitohemaglutinina (PHA). Este ensayo clasico de proliferacion de celulas mononucleares, que sirvio de modelo para la descripcion original de la ciclosporina por Borel,4 es ampliamente utilizado para la investigacion de drogas con potencial inmunosupresor.3 La fitohemaglutinina es un agente mitogeno para linfocitos humanos, que actua fundamentalmente sobre los linfocitos T.5, 6 Se utilizaron dos tipos de preparaciones celulares: una de celulas mononucleares perifericas y una de sangre entera. La preparacion de sangre entera, validada en la literatura internacional y adaptada en nuestro laboratorio7, 8 representa un modelo biologico interesante, ya que la presencia de otras celulas sanguineas durante el proceso de cultivo refleja la situacion encontrada in vitro. Estas dos preparaciones celulares fueron cultivadas a seguir, con o sin estimulo de PHA y en la presencia o en ausencia de dos preparaciones de ciclosporina diferentes, con dosis crescientes. Durante los ensayos, no fue permitido el acceso del investigador a la identidad de los medicamentos testados.
Las diferencias estadisticas observadas entre los dos preparados comerciales en los ensayos en voluntarios sanos utilizando preparaciones purificadas de celulas mononucleares se restringieron a una unica concentracion de ciclosporina (20 ng/ml). El analisis de los resultados obtenidos con la tecnica que emplea sangre entera, un procedimiento simple y de bajo costo, tambien revelo inhibicion progresiva de la proliferacion con concentraciones crecientes de ciclosporina, habiendose observado diferencias entre las dos formulaciones comerciales (en las concentraciones de 200 ng/ml y 2 ng/ml). Con base en estos resultados, se opto por realizar solamente los ensayos de proliferacion en sangre entera cuando se procesaron las muestras de los hemodialisados. Esta estrategia tiene la ventaja de permitir evaluar la accion de las ciclosporinas en presencia de factores plasmaticos potencialmente capaces de interferir con la respuesta inmune.9, 1 0 No se observaron diferencias entre el poder inhibitorio de las dos formulaciones comerciales en las diversas concentraciones testadas. En los pacientes hemodialisados, sin embargo, parecio haber una mayor sensibilidad de las celulas mononucleares a la accion antiproliferativa de la ciclosporina, reflejada por una pendiente mucho mas acentuada de la curva inhibitoria, al compararla con la obtenida en los voluntarios sanos. Esta mayor sensibilidad puede haber derivado de la accion inhibitoria de las toxinas uremicas, presentes en el ensayo en sangre entera. Esta posibilidad esta siendo investigada actualmente en nuestro laboratorio.
CONCLUSION
Ambos preparados presentaron actividad inmunosupresora equivalente in vitro, con efecto inhibitorio sobre la proliferacion de celulas mononucleares, tanto en sangre periferica como en sangre entera, en concentraciones que se estan de acuerdo con las mencionadas en la literatura.11-13 Se constato una discreta diferencia entre las dos formulaciones comerciales estudiadas, exhibiendo una tendencia para un mejor desempeno del preparado identificado como ciclosporina 2 en la preparacion de sangre entera de voluntarios sanos.
REFERENCIAS
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13. Sigal NH, Dumont FJ. Cyclosporine A, FK506 and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Ann Rev Immunol 1992;10:519-60.
1. Laboratório de Imunologia Tumoral, Departamento de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
2. Departamento de Medicina Clínica, Universidade Federal Fluminense (UFF). Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Correspondencia:
Beni Olej
Departamento de Medicina Clínica do Hospital Universitario Antonio Pedro
Rua Marques de Parana, 303, Centro
24030-000 Niteroi, RJ, Brasil
Tel. (0xx21) 9619-7279/2644-6447
E-mail: olej@terenet.com.br
Recibido en 26/7/2001.
Aprobado en 24/1/2002.
Fuente de financiamiento y conflicto de interes inexistentes.
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